大鼠低氧誘導(dǎo)因子1αelisa試劑盒采用ELISA技術(shù)，通過雙抗體夾心法或競爭法，利用純化的抗體包被微孔板，與待測樣品中的HIF-1α特異性結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再經(jīng)過洗滌、顯色和終止反應(yīng)等步驟，通過酶標(biāo)儀測定吸光度來計算樣品中HIF-1α的濃度。
一、實驗前準(zhǔn)備
1、試劑盒檢查：確認(rèn)試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)品、檢測抗體、酶結(jié)合物、底物、終止液、洗滌液等，并檢查是否在有效期內(nèi)。
2、樣本準(zhǔn)備：采集大鼠組織或細(xì)胞樣本，按要求處理（如勻漿、離心）并保存于-80°C。
3、試劑平衡：將試劑盒從冰箱取出，室溫平衡30分鐘。
4、儀器準(zhǔn)備：確保酶標(biāo)儀、移液器、離心機(jī)等設(shè)備正常工作。
二、實驗步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：按說明書將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，通常設(shè)置6-8個濃度點。
2、加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加入酶標(biāo)板孔中，每孔100μL，設(shè)置空白對照。
3、孵育：37°C孵育1-2小時，使HIF-1α與包被抗體結(jié)合。
4、洗滌：棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)3-5次。
5、加檢測抗體：每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體，37°C孵育1小時。
6、洗滌：重復(fù)洗滌步驟。
7、加酶結(jié)合物：每孔加入100μL酶結(jié)合物，37°C孵育30分鐘。
8、洗滌：再次洗滌。
9、加底物：每孔加入100μL底物溶液，避光孵育15-30分鐘。
10、終止反應(yīng)：每孔加入50μL終止液，顏色由藍(lán)變黃。
11、讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度。
三、數(shù)據(jù)分析
1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、計算樣本濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中HIF-1α的濃度。
四、注意事項
1、操作規(guī)范：避免污染，使用一次性吸頭。
2、時間控制：嚴(yán)格控制孵育和洗滌時間。
3、儀器校準(zhǔn)：確保酶標(biāo)儀和移液器準(zhǔn)確。
4、重復(fù)實驗：每個樣本至少做3次重復(fù)，確保結(jié)果可靠。
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